【导读】
肺癌是最常见、造成死亡最多的癌症，其中非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最高发的亚型。由于肿瘤的高转移能力，尽管实施了新的靶向治疗和化疗方案，但NSCLC 患者的死亡率仍然过高。癌症相关的成纤维细胞(CAFs)是肿瘤间质的主要组成部分，它是致癌、增殖和侵袭的主要原因，并且在促进癌症进展中发挥关键作用。CAFs与肿瘤细胞之间的接触已被证明可以通过激活抗凋亡途径或诱导上皮细胞向间质转化(EMT)来促进肿瘤细胞的增殖。因此，靶向CAFs可能对治疗癌症有价值。
吡非尼酮(以艾思瑞为主要代表药物，下文简称PFD)是一种吡啶类化合物，具有抗纤维化、抗炎、抗氧化的作用。有报道称吡非尼酮可以抑制CAFs的细胞活力和胶原生成，抑制CAFs在乳腺癌中诱导肿瘤生长，也有报道显示吡非尼酮使肿瘤微环境正常化。然而吡非尼酮对NSCLC抑制机制的数据还不是很多。
【研究进展】
来自日本大阪大学医学院的专家团队，进行了一项旨在进一步分析吡非尼酮在NSCLC肿瘤微环境中的作用的研究，评估PFD对正常成纤维细胞的特性，以及肺正常成纤维细胞(LNFs)和CAFs的临床样本的影响。该论文已发表在《SCIENTIFIC REPORTS》上。
【研究结果】
研究团队使用了来自不同组织类型的细胞，其中1型来自腺鳞癌，2型来自腺癌，3型来自鳞状细胞癌。
结果一：吡非尼酮抑制LNFs和CAFs的激活水平和细胞因子的产生。
如上图所示，在显微镜下，来自3个NSCLC组织的所有细胞均显示为典型的纺锤状成纤维细胞，与PFD共同处理后，无论是在CAFs还是在LNFs中，细胞生长均被抑制。
此外，如上图所示，PFD组的ACTA2、胶原蛋白我和IL-6水平也有所下降。
虽然透明质酸合成酶2(ha-2)的mRNA水平在CAFs中并不比在LNFs中高，但与PFD共处理后，其表达受到了强烈的抑制，LNFs和CAFs的平均降幅分别为0.07和0.08。Western blot分析显示了与RT-PCR相同的趋势。
在接下来检测PFD对细胞因子产生的抑制作用的试验中，ELISA检测结果显示，IL-6的浓度在CAFs中高于LNFs(1.64倍)，而TGF-β1的浓度几乎相等，仅高于LNFs(1.09倍)。吡非尼酮抑制IL-6和TGF-β1细胞因子的产生，对IL-6的抑制作用更大，平均降低0.65，而TGF-β的降低率为0.10。
结果二：CAFs和LNFs对NSCLC细胞的EMT状态有很强的影响，而吡非尼酮除了对成纤维细胞或NSCLC细胞有直接作用外，还能抑制肿瘤-基质相互作用。
为探究PFD对NSCLC细胞与CAFs或LNFs相互作用的影响，研究团队将A549和NCI-H358细胞与CAFs或LNFs共同培养。为了确定PFD对这些细胞相互作用的影响，而不是对细胞本身的影响，在培养24小时后去除PFD。
结果显示CAFs或LNFs处理后，A549细胞的形态显著改变为尖锐、不规则的形态，细胞与细胞的接触作用减弱，而PFD预处理CAFs或LNFs对这些变化表现出显著的抑制作用。
通过免疫荧光检测粘附蛋白E-cadherin的表达来评估A549细胞的粘附特性，结果如下图所示：
在CM与CAFs或LNFs的细胞接触时，E-cadherin的表达降低，在CAFs -CM处理的细胞中降低作用更明显，PFD预处理可恢复两种细胞系中E-cadherin的表达。纤维连接蛋白的表达水平随着CM的改变而升高，PFD对LNFs或CAFs的CM均有抑制作用。
用CM、CAFs或LNFs培养NSCLC细胞，观察其侵袭和迁移能力。结果如下图所示：
与未处理细胞相比，CM处理CAFs或LNFs显著增强了A549细胞的侵袭能力，其中CAFs -CM比lnf处理细胞的侵袭能力增强更明显 (图2C)。
相反，PFD预处理降低了A549细胞的侵袭。CAF或LNF CM处理A549细胞迁移也分别增加了2.60和2.70。
而PFD预处理CAFs或LNFs则抑制了A549细胞迁移(图D)。在创面愈合实验中也得到了类似的结果(图E)。
此外，与来自未处理细胞的CM相比，PFD预处理CAFs的CM可以减弱A549细胞的迁移，表明PFD预处理CAFs的CM可以减弱A549细胞的迁移。
如上图所示，A549-CM延长了a-SMA高表达CAFs的形态，而PFD预处理降低了CAFs的变化。
此外，A549细胞在CM处理后增强了CAFs的迁移和侵袭能力，而这些能力被PFD预处理A549所抑制。
结果三：人体内CAFs促进肿瘤进展，而吡非尼酮通过抑制肿瘤-间质串扰抑制肿瘤进展。
研究团队将带有CAFs的A549或NCI-H358细胞按2:1的比例移植到裸鼠背部右侧，未带CAFs的细胞移植到裸鼠背部左侧皮下，以检测PFD对体内肿瘤进展的影响。
植入后2周，开始每日给药PFD，持续3周。结果发现CAF共植入组肿瘤生长更明显，而PFD显著抑制A549细胞的肿瘤生长，NCI-H358细胞的肿瘤生长差异不明显。
在两种细胞类型中，PFD在NSCLC单独组中也显示出肿瘤生长抑制趋势。免疫组织学分析显示，共植入组E-cadherin的表达低于对照组(A549细胞中E-cadherin的表达为0.27倍，NCI-H358细胞中E-cadherin的表达为0.37倍)。
但经PFD处理后，恢复与对照组相比，共植入组a-SMA表达呈弥漫性增厚，经PFD处理后，无论是在共植入组还是单独NSCLC组，a-SMA表达均呈稀疏状。
结果四：吡非尼酮治疗人类IPF患者的过程中，还改善了人体组织中的肿瘤标记物的水平。
研究团队研究团队对接受PFD治疗的IPF患者的肿瘤标记物进行评估，包括E-cadherin、a-SMA和Ki67。作为对照，也对未进行PFD治疗的肿瘤标本进行了评估。两组患者大多数为鳞状细胞癌。
虽然E-cadherin的表达几乎相同，但在接受PFD治疗的患者肿瘤中，α- SMA阳性程度和Ki67标记指数均有所降低。
【研究结论】
上述研究在细胞水平和动物水平上，证明了吡非尼酮可以抑制促肿瘤生长因子的的产生，抑制肿瘤-基质相互作用;在人体组织水平，证明了吡非尼酮可以改善肿瘤标记物的水平。
因此，吡非尼酮(以艾思瑞为主要代表药物)可能有很大的潜力作为一种新的NSCLC治疗药物。吡非尼酮治疗NSCLC的前瞻性临床试验值得期待。
【参考文献】
Fujiwara A, Funaki S, et, al. Effects of pirfenidone targeting the tumor microenvironment and tumor-stroma interaction as a novel treatment for non-small cell lung cancer. Sci Rep.
（责任编辑：华康）
